技术干货如何去黏连？流式新手绕不开的数据处理难题

　　流式细胞术，是一种应用广泛的单细胞分析技术，常用来分析血液细胞、培养细胞等复杂细胞群体中多种细胞标志物的表达差异，能够在一定程度上帮助医学工作者了解细胞的分化、增殖和功能状态。

　　在流式检测中，我们应该进行单细胞分析，有时样品中会混有两个或多个细胞的聚集体，如图所示，我们称为粘连体，是流式检测中一类都会存在的干扰信号。对于流式新手而言，粘连体是个绕不开的话题，让我们大家一起来认识一下流式中的粘连体。

　　先来看一个典型的案例，流式最古老的应用之一就是用来分析细胞中DNA含量的变化，称为细胞周期分析，当个人会使用荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色细胞内的DNA（RNA经RAN酶处理去除），细胞核可以被488nm的激光激发，发出橙红色的荧光，碘化丙啶是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中并与之结合的荧光染料，与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。可以用流式细胞仪的荧光定量功能对细胞进行DNA含量测定，由于细胞的DNA含量在有丝分裂过程中呈现周期性的加倍再恢复的变化，根据细胞群体中DNA含量的分布情况，就可以分析出G

　　1期、S期和G2/M期细胞的比例，从而了解细胞的增殖情况。假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有加倍的DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1～2之间。如图：

　　流式检测的原理告诉我们，流式细胞仪在检测中利用流体聚焦，使样品细胞流聚焦于鞘液流中心，细胞在压力作用下排列一线，逐一通过激光检测点，与DNA含量对应的定量荧光信号被记录，生成细胞周期直方图，横坐标为荧光强度，纵坐标为颗粒数（细胞s数），正常分裂生长的细胞系会形成典型的双峰图，软件可以分析得到G

　　1峰的比例，G2/M峰的比例和两峰间S期细胞的比例，就得到了周期分析的结果。但是当流式前辈们进行这一实验时发现，细胞周期检测的G2/M期比例经常会高于实际值，这会使得对细胞增殖状态判断错误，原来有一部分粘连体信号被当作了单细胞信号计入了细胞周期分析，当两个细胞粘在一起被检测，得到的信号就是两个细胞核的荧光强度，由于通常细胞样品中G0/G1期细胞占多数，因此常见G0/G1期粘连，刚好产生双倍的DNA信号，分析时与G2/M期重合，单从荧光强度横坐标中无法分辨线/M期与粘连体。但是当两个相同的G0/G1期细胞粘在一起他们的荧光密度不会变化，也即荧光峰值不变，但是荧光总量，也就是我们正真看到的荧光检测强度会加倍，刚好位于G2/M期的荧光强度峰中，同样的道理，荧光强度不等的细胞粘连或者更多个细胞粘连就会形成荧光强度更大的细胞团，会显而易见的影响G2/M期细胞比例的分析，通常会造成G2/M期检测比例偏高，对于存在异倍体的肿瘤细胞系检测影响更复杂，甚至有可能造成异倍体的误判，因此去除粘连体是单细胞分析的关键一步。流式分析中的必经步骤——去粘连为了周期分析的精确，前辈们研究了各种识别和去除粘连信号混杂的办法，就是我们今天流式分析中的必经步骤——去粘连，最常用的是利用粘连体荧光信号总量大但信号峰值相对低的特征识别，只选取斜率一致排列的信号，严格去除峰值不足的颗粒，这样做就为了保证检测信号全部是单细胞信号，这也是流式单细胞分析的基础条件。

　　流式细胞周期分析实验是经典的流式荧光定量分析实验，通过它可以容易了解流式单细胞荧光定量的检测原理。由于使用了DNA均匀着色的荧光染料，通常直接识别灵敏的PI荧光检测信号中的低峰值信号，也可以通过细胞的散射光信号峰值差异识别粘连。也有的品牌仪器具有信号宽度参数，也可以利用信号宽度识别粘连细胞。

　　但是并非所有流式检测都染色DNA，通常荧光抗体标记也无法进行准确定量，当细胞中带有多种不同荧光要如何去除粘连体呢？

　　在多数流式检测中前向散射光信号强度与峰值的斜率截取单细胞群体是可以通用的去粘连方法，如图，主要是因为这两个信号在各类检测和各品牌仪器中都适用，因此可以作为通用的去除粘连的方法。

　　当然有。千万不要以为上机样品中都是单个细胞，分析时就不会有粘连体，另一种情况也很常见。要理解第二种情况还是要回到流式检测的流体聚焦原理，我们知道样品细胞悬液被鞘液包裹流过液流室，这个过程鞘液压力是固定的，样品细胞悬液压力可以调节，通常分为低中高三档，当低速上样，通常样品细胞可以较好的排列成单细胞队列逐个经过检测点，这时只要细胞没有互相粘附通常都是单细胞检测，但当上样压力增高样品流压力增大，流速加快，其中的细胞拥挤通过检测点，就可能出现两个或者多个细胞同时通过检测点的情况，如图，同样的道理，

　　与之前PI单色荧光定量不同，常用流式双色、三色和多色实验中粘连体信号不止表现为测量荧光强度的增强，例如一个阴性细胞和一个阳性细胞粘连，会检测到一个阳性颗粒，通常会造成阳性群体比例增加，在有些检测中可能因为粘连信号造成假的双阳性群体出现，由于检测的随机性，往往无法准确预见粘连体的影响，因此我们分析各种流式样品都应当要认真去除粘连体，尽可能保证分析单个细胞的信号。

　　同时为了能够更好的保证流式检测的精确度，在提高样品单细胞质量的基础上，细胞检测速度，上样细胞浓度都需要和检测条件匹配。

　　流式细胞术具有高速、定量、单细胞多参数的特点，只有保证分析的是真正的单细胞信号才能得得到可靠的分析结果。也许一些新手在检测中不注意区分粘连体，忘记了采集高度或宽度信号，但是当投稿给正规期刊，我们肯定会被询问数据是不是去除了粘连，没有经过去粘连分析的数据准确度下降，可以说去粘连是流式分析的基础课也是必修课。

　　徐晓雪，首都医科大学中心实验室流式平台负责人，副主任技师，2006年毕业于首都医科大学生理学专业，获理学硕士学位，加入首都医科大学医学实验与测试中心工作，同年在北京大学医药卫生分析中心学习流式技术，一直从事流式技术服务工作至今，熟悉多种型号高级流式仪器的性能与操作，参与服务多项首都医科大学及其附属医院的国家级、省部级科研项目，主要研究方向为流式细胞分析技术，始终致力于流式新技术的引进、应用与推广。本文编辑：刘立东

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